Ожирение вызывают микробы, живущие в кишечнике!

Ожирение вызывают микробы, живущие в кишечнике!

От чего зависит состав кишечной микрофлоры?

Как известно, количественный и качественный состав кишечной микробиоты (микрофлоры) зависит от многих факторов: возраст (у людей пожилого возраста снижается процент лактобактерий и бифидобактерий); общее состояние организма (наличие хронических заболеваний ЖКТ); прием лекарственных препаратов (антибиотиков); генетические особенности организма; питание.

Например, у приверженцев западной диеты (с высоким содержанием жиров) наблюдается уменьшение популяции Bacteroidetes и увеличение Firmicutes в составе кишечной микробиоты (КМ) [1].

Разумеется, тот факт, что регулярный прием жирной пищи приводит к ожирению, не является новым, но какую роль тут играет кишечная микрофлора? И что будет, если перенести часть кишечной микробиоты от мыши, страдающей ожирением, в организм стерильной (лишенной микрофлоры кишечника)? И могут ли определенные группы микроорганизмов приводить к ожирению? Давайте попробуем найти ответы на все эти вопросы.

Есть ли связь между микрофлорой и ожирением?

Ванесса Ридаура и ее коллеги поставили очень интересный эксперимент [2, 3]. Они получили образцы микрофлоры кишечника у четырех пар человеческих близнецов (в которых один из каждой пары был худым, а другой страдал ожирением).

Эти образцы вводили выращенным в стерильных условиях мышам (в кишечнике этих грызунов не было микроорганизмов) и наблюдали за тем, как животные набирают массу (см. рис. 2).

Кормили мышек кормом, богатым клетчаткой и с нормальным процентом жира.

Ожирение вызывают микробы, живущие в кишечнике! Оказалось, что те мыши, которые получили микрофлору худых людей, спустя несколько недель сохраняли нормальный процент жира в теле, а те, которым досталась кишечная микрофлора толстяков, начинали набирать вес (хоть и питались нежирной пищей). Когда мышей обеих групп после заражения помещали в одну клетку, и они начинали обмениваться микрофлорой (мыши иногда поедают фекалии), то микробиота худых «побеждала» микробиоту толстяков: обе группы мышей оставались худыми.

Похожий эксперимент проводили исследователи из Медицинской школы Мичиганского университета [4]. Поначалу биологи вырастили поколение стерильных мышек (без кишечной микрофлоры). После этого заселили их кишечник человеческими бактериями (материал взяли из фекалий здорового человека с нормальной массой тела).

Далее лабораторных грызунов разделили на две группы. Первую кормили едой с большим содержанием клетчатки, вторую — жирной и калорийной пищей, которая практически лишена клетчатки. Изначально в обеих группах показатели кала почти не отличались, но позднее были обнаружены существенные изменения.

У мышей, которые употребляли мало клетчатки, обнаруживались типичные для ожирения изменениям КМ: снижение содержания в просвете толстой кишки Bacteroidetes и увеличение численности Firmicutes. Примечательно, что животные с подобными изменениями КМ были способны усваивать больше жиров из кишечника.

Увеличение численности бактерий типа Firmicutes в кишечнике мышей при кормлении жиром находили на протяжении нескольких месяцев. Вернуть потерянную микрофлору помог только метод трансплантации фекалий. В этом случае по прошествии десяти дней после процедуры состав и разнообразие бактерий кишечника грызунов из разных групп уже нельзя было отличить.

По мнению ученых, снижение разнообразия КМ является одной из причин ожирения, и прием жирной пищи бедной клетчаткой способствует этому [1, 5].

Подобное влияние на КМ пищи с высоким содержанием жиров найдено также у человека. Увеличение потребления калорий с 2400 до 3400 ккал/сут., как у людей с ожирением, так и без него, приводили к быстрым изменениям КМ: в фекалиях наблюдалось 20-процентное увеличение количества Firmicutes и соответствующее уменьшение Bacteroidetes [6].

Исходя из результатов этих экспериментов мы можем предположить, что в организме все же есть популяция бактерий, отвечающая за ожирение, и популяция, отвечающая за снижение массы тела. И прием жирной с пониженным содержанием клетчатки пищи способствует изменениям КМ в сторону увеличения популяции бактерий, способствующих избыточному весу [7].

Как кишечная микробиота может вызывать ожирение?

Ожирение вызывают микробы, живущие в кишечнике! Разумеется, мы не можем сказать, что дисбиоз является единственной причиной ожирения, так как это полиэтиологический процесс. Тем не менее он вместе с другими предрасполагающими генетическими, экологическими и социальными факторами может привести к метаболическим нарушениям в организме. Ожирение возникает тогда, когда поступление и образование энергии превышает ее потребность, а остаток неиспользованных ресурсов депонируется в жировой ткани.

Что же является одним из основных источников энергии в организме? Разумеется, это глюкоза. Результаты эксперимента [8] выявили, что у мышей с повышенным уровнем глюкозы в крови (страдающих сахарным диабетом) состав кишечной микрофлоры аналогичен составу КМ мышей с ожирением. Значит, эти процессы тесно связаны между собой [9].

Разумеется, не все люди, имеющие лишний вес, болеют сахарным диабетом, но 80% людей с сахарным диабетом имеют ожирение и чаще по абдоминальному типу, при котором жировые отложения, в основном, формируются в области живота. В народе этот тип фигуры называют «яблоком» (см. рис. 3).

Давайте попробуем разобрать механизм, при котором глюкоза способствует ожирению. Глюкоза, попадая в кровь, повышает выработку инсулина (гормона-регулятора уровня глюкозы в крови).

Инсулин в свою очередь стимулирует синтез жиров и их отложение (за счет увеличения активности ферментов липогенеза, и в первую очередь АТФ-зависимого цитратрасщепляющего фермента) и тормозит их распад [5].

При этом если человек ведет «сидячий» образ жизни, синтезированные липиды откладываются в адипоцитах (так как энергия, поступающая извне, не используется и вынуждена откладываться в виде жировой ткани про запас).

Ожирение вызывают микробы, живущие в кишечнике! Но эти процессы происходят постоянно и в здоровом организме. Значит, для того чтобы липогенез вышел за пределы нормы, нужно либо много глюкозы, либо мало инсулина, либо нарушение взаимодействия инсулина и глюкозы. Так как мышей из эксперимента, описанного выше, кормили кормами с высоким процентом жиров, а не углеводов, значит дело не в чрезмерном поступлении глюкозы в организм. Инсулин вырабатывается β-клетками поджелудочной железы, а у мышей из предыдущих экспериментов функция железы нарушена не была. Это свидетельствало о том, что проблема не в дефиците инсулина. Хотя в 2015 году ученые выдвинули теорию о прямой связи бифидобактерий (см. рис. 4) с синтезом глюкагоноподобного пептида-1 [8, 10]. Глюкагоноподобный пептид-1 — это инкретин, то есть вырабатывается в кишечнике в ответ на пероральный прием пищи. Он оказывает влияние на различные органы и системы, в том числе усиливает секрецию инсулина. Пептид вырабатывается L-клетками, которые располагаются в слизистой оболочке подвздошной и толстой кишок, а бифидобактерии могут стимулировать его синтез. Соответственно, если в кишечнике уменьшается количество бифидобактерий, то уменьшается количество этого пептида, а следовательно, и уровень инсулина. Но эта теория еще требует детального изучения, поэтому назвать ее основной причиной повышения сахара в организме мы пока не можем. Значит, остается вариант с нарушением усвоения глюкозы — См.: Кишечная микробиота и сахарный диабет 2 типа

Ожирение и микрофлора кишечника

Владимир Трофимович Ивашкин, академик РАМН, доктор медицинских наук:

– А мы с Оксаной Михайловной остаемся, и я начну ее критиковать после того, как она расскажет нам о связи ожирения и микрофлоры кишечника. Это новое очень интересное направление.

В последних исследованиях выделено несколько факторов риска, которые продуцируются микрофлорой кишки. Это фактор риска развития сахарного диабета второго типа, это фактор риска развития ишемической болезни сердца.

И сейчас внимание кардиологов, по всей вероятности, начинает переключаться из пространства коронарных сосудов в пространство тонкой и толстой кишки.

Оксана Михайловна Драпкина, профессор, доктор медицинских наук:

– Уважаемый Владимир Трофимович, уважаемые коллеги, мы продолжаем нашу работу. И действительно, как сказал Владимир Трофимович, кишечная микрофлора и ожирение, это та область, которая, наверное, нам преподнесет еще много сюрпризов.

Мы говорим об ожирении, и я привожу основное определение ожирения. Их на самом деле довольно-таки много.

Ожирение – это многофакторное заболевание, которое развивается в результате переедания или чрезмерного употребления жирной пищи в сочетании с низкой физической активностью.

Но мы берем, конечно, элементарное ожирение, оставляя за рамками нашей дискуссии ожирение эндокринное, которое сопутствует развитию некоторых эндокринных синдромов и заболеваний.

Мы можем сказать, что ожирение – это дисбаланс между потреблением и расходом энергии. Этот дисбаланс зарождался давно – тогда, когда homo sapiens (человек разумный) начинал свою деятельность, чтобы обеспечить себя и своих близких энергией, питанием.

Но он уже тогда, как и сейчас, был существом с высокой потребностью в энергии. У нас с вами нет собственных запасов, как, например, у медведей, которые засыпают и их греет бурый жир в течение зимнего периода (бурый жир у нас в очень небольшой прослойке присутствует в определенных областях).

Это все обуславливает наш определенный сберегающий фенотип, эгоистичность этого фенотипа. В то время периоды голода чередовались с периодами изобилия, когда была удачная охота и была пища.

Как раз периоды голода и сберегающий фенотип стали предтечами к той самой инсулинорезистентности, про которую мы сейчас говорим, когда расход энергии находился под влиянием именно потребления энергии, то есть это была производная функция.

Что сейчас? Осталось то же самое. Осталась высокая потребность в энергии и отсутствие собственных запасов, остался наш сберегающий фенотип, но пища стала доступной практически всегда. Как только мы чувствуем голод, мы сразу можем пополнить свои запасы.

Кроме того, сам вид этой пищи, как ее нам преподносят в ресторанах, конечно, приводит к стимуляции аппетита. Все это приводит к поддержанию постоянно высокой концентрации нутриентов в крови.

И это, в конечном счете, опосредуется в запас липидов, ожирение, стеатоз и тот каскад, про который мы тоже часто говорили.

Но остается вопрос: почему же при одной и той же приблизительно диете питания, при одних и тех же физических нагрузках кто-то, сев на диету, достаточно хорошо теряет килограммы, а кто-то нет? И почему при одном и том же, я еще раз повторюсь, режиме питания некоторые люди обладают повышенным индексом массы тела, а другие нет? Возможно, с определенной долей допущения мы можем найти ответ на этот вопрос, заглянув в кишку или проанализировав микрофлору. Оказывается, что у нас есть еще один орган – кишечной микробиом, и весит он где-то 3 кг, что составляет приблизительно 5% от общей массы тела, если взять человека массой 60 кг. Это отдельный орган, ответственный за очень многие процессы, в том числе и метаболические процессы в организме. В принципе, если взять, например, 1 г слепой кишки, то там 2 миллиарда бактерий. Как они себя ведут, является предметом интереса сейчас очень многих ученых.

Есть археи, есть простейшие, есть бактерии. Так как удельный вес бактерий превосходит другие виды, то на них в основном я и хотела бы обратить внимание. Можно условно их подразделить на две большие группы, это протеолитические бактерии и сахаролитические бактерии.

И мы видим, что некоторые эффекты свойственны и протеолитическим бактериям, и сахаролитическим бактериям. Для себя я ставлю знак плюс перед сахаролитическими бактериями, потому что они наши основные друзья в лечении, например, ожирения (сегодня я говорю больше об этом).

А протеолитические бактерии ответственны за гнилостные процессы, за образование аммиака (немножко на этом тоже сегодня остановимся), ароматических аминов, эндогенных канцерогенов, собственно говоря, это условно патогенная флора, которая иногда при определенных условиях способна вызывать диарею.

Очень важна в каскаде реакций, которые мы сегодня будем разбирать, функция короткоцепочечных жирных кислот. Короткоцепочечные жирные кислоты ежедневно обеспечивают до 20% энергетических потребностей организма.

Их очень много, но здесь представлены функции некоторых из них: масляной, пропионовой, молочной, уксусной.

Мы видим, что они влияют на эпителиальные клетки и регуляцию их созревания, влияют на среду кишки (кислая среда, в частности, создается молочной, уксусной и пропионовой кислотой), обеспечивают некое антимикробное действие, участвуют в обмене ионов и липидов, а также влияют на моторику толстой кишки.

В состав кишечной микрофлоры различен у худых и у тучных людей. Об этом сейчас достаточно упорно свидетельствуют данные. Начиналось все, конечно, с экспериментальных моделей. Но сейчас есть данные и на добровольцах, и на пациентах, в частности на пациентах с сахарным диабетом и без сахарного диабета, что состав кишечной микрофлоры у них разный.

Я постараюсь привести данные, которые были доступны мне в медицинской литературе. Увеличивается количество Firmicutes у пациентов с ожирением и с сахарным диабетом, снижается количество бифидобактерий и количество бактероидов.

Читайте также:  Дуплексное транскраниальное УЗИ сканирование или исследование сосудов головы и шеи: расшифровка

Это одно из исследований, опубликованное довольно-таки давно – в 2004 году. Мы видим тут тучных мышей и диких мышей. Так вот, колонизация бактерий из кишки тучных мышей диким мышам приводила к тому, что они стремительно набирали вес.

Причем этот стремительный набор веса представлял из себя увеличение массы жировой ткани за 2 недели на 60%. При этом до колонизации и после колонизации не было изменений в питании этих диких худых мышей, не было изменений в их уровне инсулинорезистентности.

Таким образом, тогда был сделан предварительный вывод на экспериментальной модели, что кишечная микрофлора влияет на гены, регулирующие расход и запас энергии.

Что же происходит у людей, или тучных людей, в эпоху, когда ожирение и сахарный диабет, скажем так, гордо шагает по планете и завоевывает одну страну за другой? Здесь, конечно, пока лидер США. Было проведено такое исследование – MetaHIT project, в котором участвовали 124 добровольца.

Этот проект дал нам очень важную информацию. Оказалось, что у тучных лиц была зарегистрирована потеря шести видов бактерий, и им дали название «Low gene».

И когда проанализировали пациентов low gene, какие они имеют метаболические изменения, то оказалось, что low gene является базисом для инициации инсулинорезистентности и дислипидемии.

На следующем слайде представлены эти данные. Вот метаболические нарушения у этих пациентов, которые связаны с потерей представителей нормальной микрофлоры. Если мы посмотрим на красные столбики, а красные столбики, это те изменения уровня глюкозы, инсулина, HOMA-теста и т.д.

у пациентов с низким содержанием генов кишечной микрофлоры, то мы увидим тот клинический портрет пациента с метаболическим синдромом, с которым мы очень хорошо знакомы. Обратите внимание, статистически значимо у этих пациентов повышен уровень инсулина, статистически значимо у них повышен уровень HOMA-теста, у них статистически ниже липопротеиды высокой плотности и выше триглицериды.

Как раз эти показатели входят в основные понятия тучного гипертоника (не просто тучного человека, но и тучного гипертоника).

Если мы перейдем от генетического уровня к органному, рассмотрим механизмы, которые, возможно, опосредуют те метаболические изменения, которые были доказаны в MetaHIT project, то оказывается, что именно эндотоксемия и хроническое системное воспаление поддерживают тот плацдарм неблагоприятных реакций, которые свойственны тучному человеку.

Современные представления о взаимосвязи ожирения и кишечной микробиоты

передовая статья

© Е. А. Корниенко

ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Минздрава России

Резюме. Более 500 млн людей на Земле имеют избыточный вес, эта «эпидемия» охватывает все страны, включая Россию, и наблюдается как у взрослых, так и у детей. Обычно это объясняют изменением образа жизни и характера питания современного человека, но под влиянием питания меняется и состав кишечной микробиоты.

Участие микрофлоры в энергетическом и жировом обмене доказано в эксперименте на гнотобионтах. Заселение гнотобионтов микрофлорой от ожиревших особей способствовало развитию ожирения, независимо от диеты. Ожирение характеризуется слабой степенью хронического воспаления в жировой ткани, источником его может быть кишечная микробиота.

Липополисахариды (ЛПС)) Грам (-) кишечных бактерий через активацию TLR-4 являются главными инициаторами этого воспаления. Кишечная микробиота тучных и стройных отличается. При ожирении повышено количество клостридий и Грам (-) протеобактерий, снижено количество бактероидов и бифидобактерий.

Ряд работ продемонстрировал возможность влияния пробиотиков, особенно бифидобактерий младенческих штаммов, на некоторые проявления метаболического синдрома, в частности уровень глюкозы, инсулина, холестерина.

Ключевые слова: ожирение; кишечная микробиота; пробиотики.

УДК: 616.34-008.87:616-056.52

СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ВЗАИМОСВЯЗИ ОЖИРЕНИЯ И КИШЕЧНОЙ МИКРОБИОТЫ

Более 500 млн людей на Земле имеют избыточный вес (индекс массы тела — ИМТ=25 — 29,9 кг/м2) и 250 млн страдают ожирением (ИМТ > 30 кг/м2). Эта эпидемия охватывает как развитые, так и развивающиеся страны.

Повсеместно отмечается рост распространенности ожирения и связанных с ним заболеваний, включая сахарный диабет 2-го типа, сердечно-сосудистую патологию, гипертоническую болезнь и неалкогольную жировую болезнь печени.

Избыточный вес все чаще встречается и у детей, указывая на то, что эпидемия будет нарастать и дальше.

Ожирение развивается в результате нарушения энергетического баланса, то есть зависит от того, как организм регулирует поступление энергии, ее затраты и запасы.

Поскольку голодание эволюционно представляет большую опасность для жизни, чем переедание, наши биологические системы направлены преимущественно против потери веса, а не против его увеличения (так называемый «генотип развития»).

Но в результате экономического прогресса пища стала более доступной для человека, огромное разнообразие вкусной и высококалорийной пищи не требует больших физических затрат, проблема голодания сменилась проблемой потребления.

За последние 30 лет диета существенно изменилась, став более калорийной, и увеличилась по количеству некоторых видов пищи. Так, ежедневный калораж взрослых американских мужчин и женщин увеличился соответственно на 6,9 % и 21,7 % [45].

Американцы сейчас едят меньше мяса и больше курицы, увеличилось потребление сладостей на основе кукурузы взамен свекловичного и тростникового сахара. Изменились методы технологической обработки и приготовления продуктов. Повышение поступления энергии на фоне снижения ее потребления — тенденция, свойственная современному обществу — традиционно объясняет нарастание ожирения.

Однако систематические изменения в составе пищевого рациона могут приводить к изменению кишечного микробиома.

Так, сравнительное исследование кишечной микробиоты детей Буркина Фасо, ведущих первобытный образ жизни и питающихся богатой пищевыми волокнами пищей, и итальянских детей, получающих традиционную «западную» диету, показало, что ее состав существенно отличается в этих популяциях [12].

У детей Буркина Фасо доминирующим классом бактерий являются Bacteroidetes, а у итальянцев — Fermicutes. Диета через микрофлору может влиять на структуру человеческого генома. Иллюстрацией этого утверждения было обнаружение микробной Р-порфириназы у японцев.

Zobellia galactanivorans является свойственным морским обитателям членом семейства Bacteroidetes и может перерабатывать порфирин из багряных водорослей. Гомологичные Z.galactanivorans гены есть у представителя кишечной микрофлоры Bacteroides plebeius, который обнаружен только у японцев, но ни у одного из американцев.

Вероятно, ген порфириназы из 2^а1а^атуотт или другой родственной бактерии был приобретен через горизонтальный путь передачи представителями резидентной микрофлоры японцев, которые употребляют морскую необработанную нестерильную пищу, а затем этот ген стал передаваться с микроорганизмами кишечника другим поколениям японцев, распространяясь в японской популяции вертикально [19].

До недавнего времени наши знания относительно состава кишечной микробиоты базировались на данных бактериологических исследований кала, возможности которых весьма ограничены. С развитием современных молекулярно-генетических методов знания существенно расширились.

Секве-нирование генов 16S рибосомальной РНК амплифи-цированных бактериальных нуклеиновых кислот, полученных из фекалий или биоптатов слизистой оболочки кишечника, позволило по-новому идентифицировать и классифицировать представителей кишечной микробиоты.

Спектр обитателей оказался более разнообразным, чем предполагалось, были выявлены ранее неизвестные экосистемы. Установлено, что ЖКТ взрослого человека содержит примерно 1012 микроорганизмов в 1 мл содержимого, которые представлены приблизительно 1000 видов.

В последних работах показано, что это число может быть гораздо больше — по крайней мере, 1800 родов и 15 000-36 000 видов бактерий [13].

Обитатели кишечника могут быть подразделены на 3 семейства: 1) эукариоты, содержащие ядерную мембрану, отделяющую геном от клеточного материала, 2) бактерии и 3) археа, которые относятся к прокариотам, лишенным ДНК-содержащего ядра. Доминирующим семейством являются бактерии (табл. 1).

Используя технику клонирования, Р. В. ЕскЬищ с соавт. [15] установили, что доминирующими классами в кишечнике человека являются Bacteroidetes

и Fermicutes, они составляют более 90 % всех бактерий, а среди археа доминирует Methanobrevibacter smithii — потребляющий водород метаноген.

Несмотря на ограниченные данные, касающиеся состава кишечной микрофлоры, доказано, что становление микробиоценоза происходит преимущественно в первый год жизни ребенка, при этом трансформация во взрослый биоценоз зависит от целого ряда генетических и внешних факторов, прежде всего — диеты и состояния ЖКТ.

В дальнейшем кишечная микро-биота взрослого человека отличается индивидуальностью и стабильностью [26].

Эта стабильность, вероятно, является следствием развития иммунологической толерантности к приобретенной в раннем возрасте микрофлоре, позволяющей распознавать ее в дальнейшем как свою, в отличие от микробов, проникающих в ЖКТ в более старшем возрасте, когда микробиоценоз в целом уже установился [38].

Нормальная кишечная микрофлора выполняет 3 основные важнейшие функции:

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

1. Метаболическую, переваривая различные пищевые ингредиенты и синтезируя новые, оказывая тем самым влияние на метаболизм макроорганизма в целом.

2. Защитную, способствуя укреплению кишечного барьера за счет укрепления межклеточных соединений, увеличения синтеза муцина и усиления процессов регенерации эпителия.

3. Иммуногенную, постоянно взаимодействуя с иммунной системой кишечника, регулируя иммунный ответ и способствуя формированию иммунологической толерантности.

Эти функции могут нарушаться в случае нарушения становления биоценоза и изменения его состава.

МЕТАБОЛИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ

В 2010 г. был расшифрован каталог генов кишечной микробиоты 124 европейских жителей [31], он составил более 3,3 млн генов, то есть общий геном микробиоты кишечника превосходит геном человека примерно в 150 раз. Учитывая активное участие микробиоты в ассимиляции пищи, она может рассматриваться как метаболический «орган».

Она активно участвует в расщеплении и продукции важных органических субстанций, которые затем могут влиять на обменные процессы организма-хозяина. Метаболические возможности микробиоты подстраиваются к особенностям макроорганизма, дополняя отсутствующие у человека функции.

Прежде всего, кишечная микрофлора способна расщеплять растительные полисахариды, пищевые волокна, которые не перевариваются ферментными системами человека.

  • Таблица 1
  • Современные представления о составе кишечной микробиоты
  • Класс Род
  • Bacteriae
  • Firmicutes Ruminococcus
  • Clostridium
  • Peptostreptococcus
  • Lactobacillus
  • Enterococcus

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

  1. Bacteroidetes Bacteroides
  2. Proteobacteria Desulfovibrio
  3. Escherichia
  4. Helicobacter
  5. Verrucomicrobia
  6. Actinobacteria Bifidobacterium
  7. Cyanobacteria
  8. Synergistes
  9. Archaea
  10. Euryarchaeota Methanobrevibacter

Короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК) являются самым ярким примером участия микробиоты в обмене и влияния на иммунитет.

Пищевые волокна не перевариваются в кишечнике, поскольку мы генетически не обладаем необходимым набором ферментов: гликозид-гидролаз и полисахарид-лиаз, необходимых для расщепления различных гликозидных связей, присутствующих в гликанах. Эти отсутствующие ферменты восполняются микрофлорой.

КЦЖК являются важным энергетическим ресурсом для организма хозяина, обеспечивая более 10 % его энергопотребности.

В раннем возрасте, когда основными представителями кишечной микробиоты являются бифидобакте-рии, среди КЦЖК доминирует ацетат, впоследствии, с увеличением доли облигатных анаэробов, возрастает количество бутирата и пропионата. КЦЖК оказывают воздействие и на иммунитет.

Бутират усиливает регенерацию и снижает пролиферацию кишечного эпителия, а также модифицирует продукцию цитоки-нов ^-клетками и укрепляет плотность межклеточных соединений, что, в свою очередь, препятствует проникновению микрофлоры и предотвращает аберрантный воспалительный ответ.

Читайте также:  Имя мне – легион

Продукция ацетата оказывает противовоспалительный эффект, благодаря воздействию на рецептор GPR43 [23]. Недавние исследования показали роль ацетата в усилении барьерных функций эпителия. КЦЖК могут регулировать ацетилирование лизиновых остатков — ковалентную модификацию белков, вовлеченных в различные сигнальные и метаболические процессы. Обсуждается роль ковалентных и нековалентных связей продуктов микробного происхождения на продукцию белков организмом хозяина, что может оказывать длительный импринтинг-эффект. Показано эпигенетическое воздействие ацетата и бутирата.

В серии экспериментов F. Backhed с соавт. [2] на примере нормальных и генетически модифицированных мышей выявлены способы влияния ми-кробиоты на энергетические процессы и жировой обмен организма хозяина.

Сравнивались гнотоби-онты (ГБ), обычные мыши (О) и гнотобионты, которые в течение 14 дней были колонизированы микрофлорой от обычных мышей (К).

Взрослые О-мыши имели значительно большую массу жировой ткани (на 42 %), по сравнению с ГБ (по данным двойной энергетической рентгенологической абсорбциоме-трии). Вес жировых подвесок сальника у О-мышей был на 47 % выше.

При этом потребление стандартного корма О-мышами было на 29 % меньше, чем у ГБ. 14-дневная колонизация гнотобионтов (К), которые имели параметры, аналогичные ГБ, приводила к быстрому нарастанию жировой массы (на 57 %) и массы жировых подвесок (на 61 %). Параллельно отмечено снижение потребления корма (на 27 %).

Исследование активности цикла трикарбоновых кислот в ткани мышц и печени К-мышей показало значительное их повышение, что свидетельствует об активации обменных процессов после колонизации. Несмотря на это, запасы высокоэнергетических фосфатов в тканях не увеличивались. Повышение энергопотребности без нарастания энергозапасов указывает на особый, сжигающий характер метаболизма.

Исследование уровня лептина (гормона, продуцируемого жировой тканью и отражающего содержание жира в адипоцитах) показало, что он увеличивается после колонизации пропорционально нарастанию жировой массы. Этот гормон снижает потребность в пище и повышает энергозатраты.

При этом в крови отмечается повышение уровня глюкозы и инсулина, а также нарастает инсулинорезистентность, определяемая по тестам толерантности к глюкозе и инсулину. Глюкоза и инсулин усиливают процессы липогенеза в печени. Уровень триглициридов в печени у К-мышей увеличивался в 2,3 раза.

ПЦР-анализ показал увеличение в печени двух ферментов, способствующих синтезу жирных кислот (ЖК) de novo: ацетил-коэнзим-А-карбоксилазы (ACC1) и синтета-зы ЖК (Fas). Два фактора транскрипции (SREBP-1 и ChREBP) регулируют липогенетический ответ гепа-тоцитов на инсулин и глюкозу и действуют синергиче-ски.

ПЦР-анализ показал, что у К-мышей отмечается повышение ChREBP-РНК и, несколько в меньшей степени — SREBP-1-РНК. С помощью кишечного лава-жа было получено прямое доказательство, что микро-биота активирует также всасывание моносахаридов.

Таким образом, кишечная микрофлора обеспечивает расщепление растительных полисахаридов, всасывание сахаров в кишечнике и поступление их в печень, а также усиливает процессы липогенеза в печени за счет активации липогенных ферментов (рис. 1).

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Рис. 1. Механизмы ожирения, обусловленные кишечной микробиотой

Липопротеин-липаза (ЛПЛ) является ключевым регулятором освобождения ЖК из богатых триглицеридами липопротеинов в мышцах, сердце и жировой ткани. Увеличение активности ЛПЛ усиливает захват ЖК клетками и накопление триглице-ридов в адипоцитах. В белом жире активность ЛПЛ повышается после еды.

У К-мышей активность ЛПЛ в эпидидимальной жировой ткани повысилась на 122 %, а в сердце — на 99 %. Ингибитором ЛПЛ в буром и белом жире является Fiaf (ангиопоетин-подобный белок, или индуцированный голодом ади-поцитарный фактор).

Колонизация ГБ-мышей способствует снижению активности Fiaf в кишечнике, но не в печени и белом жире, это снижение происходит в дифференцированных энтероцитах ворсинок и отражает процесс созревания эпителия тонкой кишки под воздействием микрофлоры.

Эти данные свидетельствуют о том, что микробиота усиливает опосредованное ЛПЛ включение триглицеридов в адипоциты за счет подавления ее ингибитора Fiaf.

В другой работе F. Backhed с соавт. [3] на основании исследования мышей-гнотобионтов, получавших западную диету, богатую жирами и углеводами, были определены 2 механизма, которые усиливают метаболизм жирных кислот:

1. Повышение уровня Fiaf стимулирует продукцию коактиватора PPAR-y (peroxisome proHferator-activated receptor у), который усиливает экспрессию генов, контролирующих окисление жирных кислот в митохондриях.

2. Повышение АМФ-активированной протеин-киназы (АМПК) — фермента, который функционирует как датчик расхода топлива, регулируя энергетический статус клетки.

Он активируется при увеличении соотношения АМФ/АТФ в клетке, приводя к уменьшению потребления АТФ за счет подавления энергозатратного анаболического пути и увеличивает АТФ-генерирующий катаболический путь (окисление жирных кислот) [21].

Повышение активности АМПК (например, при голодании, а также у гнотобионтов) сопровождается усилением окисления ЖК в скелетных мышцах и печени и создает большую зависимость от поступления жиров. Заселение кишечника микрофлорой смещает энергообмен в сторону углеводов, как предпочтительных для бактерий источников энергии.

Эти данные подтверждают, что кишечная микро-биота может воздействовать на обе стороны энергетического баланса организма: получение энергии из пищи, а также ее потребление и создание запасов энергии.

В экспериментальном исследовании P. J. Turn-baugh с соавт. [41] у генетически предрасположен-

ных к ожирению лептин-дефицитных мышей были обнаружены особенности генотипа микробиоты, в частности, выявлены гены, кодирующие ферменты, расщепляющие непереваримые полисахариды.

Авторы также наблюдали увеличение продуктов этой ферментации (ацетата и бутирата) в кишечнике и уменьшение потерь калорий с калом у ожиревших мышей.

Пересадка микрофлоры от этих ожиревших мышей к обычным гнотобионтам привела к большей экстракции калорий из пищи, чем у таких же животных, колонизированных микрофлорой от обычных, неожиревших мышей.

Через 2 недели у первых наблюдалась отчетливая тенденция к более быстрой динамике веса и накоплению жировой ткани (47 % против 27 %). При равном количестве корма различие в поступлении калорий составило 2 % калоража. Эти данные еще раз подтвердили участие кишечной микрофлоры в энергетическом обмене и значение микробной составляющей в общем патогенезе ожирения.

Индивидуальные различия энергообмена, наблюдаемые у людей, объясняют факт, что многие пациенты страдают ожирением, несмотря на относительно небольшое потребление пищи. Это, в частности, может быть следствием индивидуального состава кишечного микробиома, определенные характеристики которого могут предрасполагать к ожирению.

иммуногенное действие кишечной микробиоты. хроническое системное воспаление

Пакеты лекций

Число людей с ожирением в последние десятилетия стремительно возрастает. Сегодня во всем мире более 300 млн. людей страдают ожирением (индекс массы тела [ИМТ] больше 30 кг/м²), еще 800 млн. имеют повышенный вес (ИМТ = 25-30 кг/м²).

Распространенность и причинная связь с ожирением таких заболеваний как сахарный диабет 2-типа (СД2) и атеросклероз определяют актуальность и большой интерес врачей и исследователей к этой проблеме. Среди многих аспектов ожирения в последнее десятилетие особое внимание привлекает роль и значение изменения кишечной микрофлоры (КМ).

Обусловлено это тем, что внедрение новых методов исследования значительно дополнили и расширили наши знания о КМ. С другой стороны, экспериментальные исслeдования демонстрируют патогенетическое значение КМ при ожирении животных.

Сравнение групп грызунов, выращенных в стерильных условиях и не имеющих КМ, с животными, выращенных в обычной среде, соответственно, с типичной КМ, показало, что кормление высококалорийной пищей вызывает ожирение у вторых, но не у грызунов без КМ.

Пересадка микроорганизмов из слепой кишки мышей с ожирением животным без КМ приводило у последних к ожирению, даже при уменьшении калорийности пищи [1]. Следовательно, наличие КМ, по крайней мере у грызунов, обязательное условие развития алиментарного ожирения.

  Микроорганизмов в желудочно-кишечном тракте у здорового человека существенно больше, чем в других биотопах организма (кожа, дыхательные пути, урогенитальная система). Наиболее плотно заселена толстая кишка. В 1 грамме содержимого толстой кишки определяют 1011−1012 бактериальных клеток. Бактерии составляют около 50-60% сухой массы фекалий.

Исследования КМ у людей показали чрезвычайно широкий спектр индивидуальных различий, зависимость от особенностей питания, образа жизни, возраста, времени года, генетических особенностей организма.

У здоровых людей в толстой кишке и фекалиях определяется 4 рода бактерий: Bacteroeidetes, Firmicutes, Actinobacteria и Proteobacteria, в свою очередь состоящие из многих групп, классов и видов микроорганизмов [2]. Есть также грибы и археи, но они составляют очень небольшой процент от общей мaccы KM (0,05% и 1% соответственно).

Всего в кишечнике обитает около 1500 различных видов микроорганизмов. Абсолютное большинство из них анаэробны. Больше чем 90% микрофлоры дистального кишечника у здоровых людей составляют микроорганизмы рода Bacteroidetes и Firmicutes [3].

Firmicutes, являющийся крупнейшим бактериальным родом, включает в себя более 200 видов, преимущественно грамположительных бактерий, в том числе лактобациллы. Род Bacteroidetes представлен грамотрицательными бактериями. Род Actinobacterium тип состоит из грамположительных бактерий.

Важнейшими представителями этого рода являются бифидумбактерии, растущие при потреблении пребиотиков, растительной клетчатки, и способныe стимулировать рост других видов микрофлоры [4]. Следует отметить, что бифидумбактерии представляют собой важную и сложную группу бактерий, присутствие которых часто связано с полезными для здоровья эффектами. Полагают, что количество бифидумбактерий в кишечнике отражает состояние и уровень здоровья организма хозяина. До 5% микрофлоры толстой кишки составляют аэробные микроорганизмы: эшерихии, энтерококки, стафилококки, различные виды условно–патогенных энтеробактерий (протей, энтеробактер, цитробактер, серрации и др.), неферментирующие бактерии (псевдомонады, ацинетобактер), дрожжеподобные грибы рода Сandida и др. Наиболее известный и изученный представитель КМ это кишечная палочка. Связано это не столько со значимостью, сколько с простотой культивирования этого микроорганизма и использования его в качестве модели при множестве экспериментальных исследований. 

КМ питается за счет остатков непереваренной и не усвоенной в кишке пищи, в первую очередь, баластных веществ, устойчивых к пищеварительным ферментам крахмалов, определенных полисахаридов, а также вторичных растительных продуктов и белков, синтезированных в тонкой кишке. Источником питания КМ также является муцин, секретируемый стенкой толстой кишки. Совокупность этих питательных продуктов имеет решающее значение для видового состава КМ.

Количественные и качественные отклонения КМ, понимаемые как патологический синдром, получивший различные наименования: дисбактериоз, дисбиотические нарушения, синдром избыточного бактериального роста, могут иметь значение в патогенезе различных заболеваний, в первую очередь, функциональных и органических заболеваниях кишечника.

Продуцируя токсины и канцерогены КМ может также способствовать развитию сепсиса, злокачественных заболеваний, недостаточности различных органов и систем.

  При ожирении выявлены типичные изменения КМ: увеличение количества микробов рода Firmicutes и уменьшение количества микробов рода Bacteroeidetes, что особенно наглядно демонстрируется исследованиями грызунов.

У мышей с ожирением микробы рода Firmicutes составляют 80 % всей КМ (у контрольных животных 60 %), а число микробов рода Bacteroeidetes уменьшается наполовину (с 40 до 20 %), по сравнению с мышами с нормальным весом [5]. Аналогичное увеличение соотношения Firmicutes/Bacteroeidetes наблюдалось в различных группах людей с ожирением [6, 7]. 

Гипотеза специфической модуляции КМ вследствии ожирения была также подтверждена исследованиями отдельных видов микроорганизмов. В частности найдено, что при ожирении уменьшается количество бифидумбактерий [8], но растет число Staphylococcus aureus [9]. Противоречивые результаты получены при исследовании лактобацилл.

Сообщалось об увеличении количества лактобацилл при ожирении [10]. Другими исследователями установлено, что потеря веса за счет ограничения калорийности пищи и физической активности у подростков увеличивает число лактобацилл в толстой кишке [11].

Читайте также:  Что показывает МРТ крестцово-подвздошных (илеосакральных) сочленений с жироподавлением?

Лактобациллы являются одним из видов микробов рода Firmicutes, число которых согласно большинству опубликованных исследований при ожирении существенно увеличено. 

Следует подчеркнуть, что не все исследователи находили описанные выше изменения КМ при ожирении. Применение такого нового метода исследования как анализ секвенированных бактериальных генов 16S рРНК показало, что изменения КМ при ожирении у человека не столь уж однозначны.

В ряде работ вовсе не было найдено различий КМ у лиц с ожирением и нормальным весом [12]. Однако даже в этих исследованиях находили отличия КМ при ожирении. Оказалось, что КМ у лиц с ожирением продуцирует больше энергетического субстрата (бутирата) по сравнению с КМ худых людей [13].

Также установлено, что при ожирении в кишечнике определяется достоверно больше генов, характерных для бактерий, синтезирующих короткоцепочные жирные кислоты [13]. Это согласуется с наблюдениями, показавшими различия в уровне микробных метаболитов в моче при сравнении лиц, страдающих ожирением, и без него [14].

Таким образом, при всей противоречивости данных можно заключить, что КМ при ожирении претерпевает определенные и, вероятно, специфические изменения. 

Проблема соотношения ожирения и состава КМ существенно осложняется известным фактом влияния характера питания на различные микроорганизмы желудочно-кишечного тракта. Одним из факторов развития ожирения как известно является избыточное питание, в первую очередь, за счет жирной пищи. Поэтому особый интерес представляют данные о влиянии пищи, обогащенной жирами, на состав КМ.

Кормление животных подобной пищей даже в случае сохранения низкого веса приводило к типичным для ожирения изменениям КМ: к снижению содержания в просвете толстой кишки Bacteroidetes и увеличению  численности Firmicutes [15]. При этом увеличивалось также число микроорганизмов, ответственных за переработку сахара в кишечнике [15].

Примечательно, что животные с подобными изменениями КМ были способны усваивать больше жиров из кишечника. Увеличение Firmicutes в кишечнике при кормлении жиром мышей находили на протяжении многих месяцев [14].

Также сообщается, что кормление грызунов пищей с высоким содержанием жиров ассоциировалось с увеличением семейства Lachnospiraceae и классов Bacteroides и Mucispirillum, в то время как обезжиренная пища было связана с увеличением семейства Allobaculum [16]. Подобное влияние на КМ пищи с высоким содержанием жиров найдено также у человека.

Увеличение потребления калорий от 2400 до 3400 ккал / сут как у людей с ожирением, так и без него, приводили к быстрым изменениям КМ: в фекалиях наблюдалось 20%-ное увеличение количества Firmicutes и соответствующее уменьшение Bacteroidetes [12].

Соотношение между Firmicutes и Bacteroidetes динамично отражает вес человека и смещается в сторону Bacteroidetes, если ожирение уменьшается. На сегодняшний день самым эффективным средством для лечения ожирения является желудочно-кишечное шунтирование. Оказалось, что после этой операции существенно изменяется состав КМ.

Наряду со снижением веса находили уменьшение относительного числа микробов рода Firmicutes, существенно повышенного до оперативного вмешательства.

Повышенное количество микроорганизмов вида Prevotellaceae до операции снижалось после нее до уровня здоровых людей без повышения веса, тогда как другие бактерии, такие как вид энтеробактерий Akkermansia, увеличивался.

Снижение веса после бариатрической операции у лиц с ожирением сопровождалось уменьшением количества бифидумбактерий в фекалиях [18]. В другом клиническом исследовании показано увеличение количество фекальной E. coli спустя 3 и 6 месяцев после желудочно-кишечного шунтирования. 

У животных после операции шунтирования отмечалось увеличение доли Enterobacter hormaechei на 200 — и 42,8 раза спустя 2 и 8 недель соответственно [19]. Так как E.

coli и Enterobacter hormaechei принадлежат к семейству энтеробактерий, их пропорциональное увеличение может быть прямым следствием операции желудочно-кишечного шунтирования.  Снижение веса при ограничении калорийности пищи также сопровождалось изменениями КМ.

У 12 больных с ожирением при снижении веса до нормального уровня за счет ограничения калорийности пищи спустя 52 недели отношение Firmicutes к Bacteroidetes снижалось до уровня, характерного для здоровых людей без ожирения [6].

У подростков с ожирением 10 недельное ограничение калорийности пищи в сочетании с физическими упражнениями, приводившее к снижению веса более чем на 4 кг, в фекалиях наблюдалось значительное увеличение Bacteroidetes [11].

Эта же группа исследователей установила положительную корреляцию отношения Bacteroides / Prevotella с весом человека [20]. В другом исследование нашли, что уменьшение веса при ожирении за счет диетических ограничений и повышения физической активности привело к уменьшению количества Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium breve при одновременном увеличении количества Bifidobacterium catenulatum [11].

Таким образом, ожирение сопровождается типичными изменениями КМ. Употребление высококалорийной пищи (наиболее значимого фактора патогенеза ожирения) вызывает сдвиги КМ, аналогичные наблюдаемым при ожирении. Тем самым однозначно обозначить причину изменений КМ у лиц с повышенным весом — избыточное питание или ожирение — весьма сложно.

Проблема причинно-следственной связи изменений КМ и ожирения остается нерешенной. Влияние КМ на метаболические процессы несомненно. Наличие микроорганизмов в кишечнике необходимое условие развития ожирения. Есть все основания полагать, что изменения КМ могут быть частично ответственны за развитие ожирения. С другой стороны, ожирение влияет на КМ.

Количественный и качественный состав КМ человека помимо прочего определяется генетическими особенностями. Наряду с этим несомненна генетическая предрасположенность к ожирению. Поэтому можно предположить, что определенные генетические изменения способствуют как развитию ожирения, так и сдвигам видового состава КМ.

  Функции КМ весьма разнообразны, часть из них эссециальна для организма хозяина.

Важнейшими являются иммуномодуляция [21], обеспечение витаминами (тиамином, рибофлавином, пиридоксином, B12, K), обеспечение слизистой оболочки кишечника энергетическим субстратом – бутиратом [22], стимуляция перистальтики кишечника, продукция короткоцепочных жирных кислот (бутират, уксусная кислота, пропионовая кислота) [23], обезвреживание ксенобиотиков [24].

КМ весьма активно участвует в метаболических процессах хозяина. Наряду с указанными выше производству витаминов, короткоцепочных жирных кислот, к метаболическим функциям микрофлоры кишечника относится синтез аминокислот, лактата, этанола, сукцината, формиата, капроата, изобутиратов, изовалериановой кислоты, а также биотрансформация желчных кислот. Последние, как и короткоцепочные жирные кислоты, влияют на уровень холестерина и метаболизм глюкозы [25].

Важное значение имеет пищеварительная функция КМ [22]. Микроорганизмы участвует в переваривании остатков пищи, поступающей в толстую кишку. За счет КМ увеличивается примерно на 10 % количество усваеваемой организмом человека энергии.

Причем у лиц с ожирением пищеварительная деятельность КМ выше, чем без ожирения. Найдено, что КМ людей с ожирением содержит повышенное количество ферментов, расщепляющих крахмал и другие полисахариды. Это ведет к увеличению усвоения энергии из употребленной пищи и способствует дальнейшему повышению веса.

Наконец, КМ определяет состояние кишечного барьера. Установлено, что определенные изменения КМ при ожирении приводят к нарушению барьерной функции кишечника.

В результате из просвета кишки в организм проникает повышенное количество микроорганизмов и способствуют развитию хронического слабо выраженного воспаления жировой ткани, которое,  в свою очередь, известно как патогенетический фактор ожирения [26].

Следовательно, при ожирении меняется определенным образом не только видовой состав КМ, но и ее физиологические свойства. КМ при ожирении характеризуется повышенной пищеварительной активностью, способностью экстрагировать из пищи большее количество энергии, а также повышать проницаемость кишечного барьера.

При всей сложности вопроса взаимосвязи КМ и ожирения совокупность полученных данных, особенно результатов экспериментальных исследований, обосновывают положение, что изменения КМ могут способствовать развитию ожирения. Это оправдывает поиск методов влияния на КМ с целью лечения ожирения. Изучается несколько возможных направлений.

Попытки модифицировать питание с целью изменения КМ и влиять на ожирение пока не принесли желаемых результатов. Опубликованные работы о влиянии различных диет и компонентов пищи на КМ столь противоречивы, что их систематизация и разработка схем воздействия на микрофлору кишечника с помощью специфически действующих диет чрезвычайно сложно.

Гораздо больше данных накоплено о применении пребиотиков, пробиотиков, а также синбиотиков и полифенолов, за счет которых достигаются целенаправленные изменения КМ. Пробиотики это препараты, содержащие живые бактерии – естественные представители нормальной микрофлоры кишечника.

Большинство ныне используемых пробиотиков содержат штаммы бифидо – и лактобактерий. Реже применяются препараты кишечной палочки, дрожей (Saccharomyces).

Гипотезa о положительном влиянии пробиотиков обоснована лауреатом нобелевской премии Ильей Ильичем Мечниковым, который еще в 1901 году описал положительное действие на иммунную систему ежедневного употребления йогуртов, содержащих бактерии, продуцирующих молочную кислоту.

Несмотря на интенсивные исследования механизм действия пробиотиков остается неясным. При регулярном применении пробиотиков достигается улучшение состава КМ. Полагают, что пробиотические бактерии продуцируют бактериоцины, угнетающих рост конкурирующих микроорганизмов.

Пробиотики стимулируют компоненты иммунной системы, представленных в слизистой кишечника. Последнее обусловливает продукцию секреторных иммуноглобулинов А, выделяющихся в просвет кишечника и прикрепляющихся к слизистой стенке, что усиливает иммунную устойчивость организма.

Пробиотики ингибируют продукцию интерлейкина (ИЛ)-6, ИЛ-8 и повышают продукцию ИЛ-10, снижают активность нуклеарного фактора NF-κB, ФНОα, интерферона-гамма. Положительное влияние пробиотиков при ожирении также связывается с угнетающим действием на повышенную проницаемость кишечного барьера, предупреждением апоптоза интестинальных эпителиальных клеток, повышением экспрессии муцина, уменьшением транслокации микроорганизмов и эндотоксемии [27], и в итоге, уменьшением выраженности  субклинического воспаления жировой ткани, известного фактора патогенеза ожирения. 

Пребиотики – неперевариваемые компоненты пищевых продуктов, влияющих на рост и активность множества бактерий кишечника, что положительно сказывается на здоровье хозяина. Большинство пребиотиков являются углеводами: олигосахариды, инулин, лактулоза, фруктаны, олигофруктозы и др.

Пребиотики встречаются во многих растительных продуктах (особенно много их в цикории, топинамбуре, козлобороднике), а также вырабатываются промышленным путем (напр., лактулоза производится из лактозы).

В неизменном виде пребиотики поступают в толстую кишку, где подвергаются бактериальной ферментации с образованием метаболитов, стимулирующих рост и развитие эн¬догенных бактерий.

Пребиотики стимулируют рост бифидо- и лактобактерий, снижают рН содержимого кишечника, регулируют физиологическую леятельность кишечника, продукцию короткоцепочных жирных кислот, угнетают образование ФНОα, ИЛ-8, лейкотриенов [27]. Сочетание пре– и про¬биотиков (препарат синбиотик) обеспечивает бо¬лее высокий и длительный положительный ответ, чем если они используются раздельно. 

Оставьте комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Adblock
detector